1 ? 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)“翹尾”的原因是什么，該如何處理？
答：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)兩種翹尾情況，一種是陰性對(duì)照出現(xiàn)翹尾，基本可以判定為陽(yáng)性質(zhì)控或者陽(yáng)性樣本污染導(dǎo)致；另外一種是樣品出現(xiàn)翹尾。如果樣品呈現(xiàn)翹尾現(xiàn)象，則有可能是由于陽(yáng)性污染、非特異性擴(kuò)增和目的基因濃度低。其中，非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)的翹尾主要是因?yàn)槟承┰噭┖猩a(chǎn)廠家使用的引物、探針不合理，生產(chǎn)工藝不達(dá)標(biāo)，特點(diǎn)是樣品出現(xiàn)大面積翹尾現(xiàn)象。如果只是個(gè)別樣品出現(xiàn)翹尾，可以按照以下步驟處理①、將原樣本和重新采集豬場(chǎng)樣品進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢仍然翹尾，判為低濃度病毒陽(yáng)性。②、如果復(fù)檢都為陰性，則有可能是實(shí)驗(yàn)室存在氣溶膠污染，就要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面的通風(fēng)、消毒處理，消殺后對(duì)環(huán)境、設(shè)備、耗材等進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)消殺效果。
2 ? 陽(yáng)性對(duì)照或陽(yáng)性樣本不顯示CT值及解決方案。
答：1）若陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型曲線，但結(jié)果不顯示CT值，出現(xiàn)這種情況的主要原因是儀器自動(dòng)閾值線過(guò)高或過(guò)低。解決方案：通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)閾值線解決此問(wèn)題，閾值線一般設(shè)置在陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增的起始，并高于陰性對(duì)照曲線。2）若陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增曲線，原因包括①、陽(yáng)性對(duì)照未充分溶解或者陽(yáng)性對(duì)照降解。解決方案：A、等陽(yáng)性對(duì)照完全溶解后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。B、打開(kāi)新的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若新的陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有問(wèn)題，表示舊的陽(yáng)性對(duì)照降解。②、PCR反應(yīng)液存在降解。解決方案：打開(kāi)新的PCR反應(yīng)液，使用同一陽(yáng)性對(duì)照做交叉實(shí)驗(yàn)，若新的PCR反應(yīng)液沒(méi)有問(wèn)題，表示舊的PCR反應(yīng)液降解。
3 ? PCR管蓋未蓋嚴(yán)，導(dǎo)致里面的液體蒸發(fā)，是否會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，導(dǎo)致環(huán)境污染？
答：陽(yáng)性質(zhì)控品和擴(kuò)增后的陽(yáng)性樣本含有大量的目的基因片段，探針?lè)晒釶CR的目的片段大小一般介于60-150bp之間，質(zhì)量很小，容易隨液體蒸發(fā)揮發(fā)到空氣當(dāng)中，形成氣溶膠。積累到一定的程度，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，在下次做PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此在實(shí)驗(yàn)之前一定要將管蓋蓋緊，同時(shí)對(duì)于新批次的PCR管，建議做氣密性檢測(cè)，防止氣密性不嚴(yán)導(dǎo)致環(huán)境污染。
4 ? 非洲豬瘟檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀？
答：非洲豬瘟檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合的原因主要有：①、豬只處于感染初期的窗口期或者間歇性排毒期，在采樣時(shí)未能采集到病毒。②、采樣是否具有代表性，若采集的樣本沒(méi)有代表性，會(huì)造成結(jié)果的假陰性，如對(duì)活豬盡量采集喉部拭子及抗凝血，病死豬采集脾臟和淋巴結(jié)，同時(shí)使用含內(nèi)源基因的非洲豬瘟病毒試劑盒監(jiān)測(cè)采樣有效性。③、送樣過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間未使用冷藏運(yùn)輸造成病毒降解，檢測(cè)人員處理樣本時(shí)未充分混勻等均可造成假陰性結(jié)果。5 ? 非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)過(guò)程中，熒光抑制物有哪些？
答：整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中，主要涉及核酸提取和PCR擴(kuò)增兩個(gè)環(huán)節(jié)，采集的樣本中含有許多成分會(huì)影響PCR反應(yīng)進(jìn)程，包括病毒的提取效率、聚合酶的活性和病毒的穩(wěn)定性。主要的抑制物有內(nèi)源性和外源性兩種①、內(nèi)源性：天然純正于標(biāo)本中的標(biāo)本組成成分，如免疫球蛋白、蛋白酶、血紅蛋白、脂類、黏蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。②、外源性：肝素抗凝劑、纖維素、硝酸纖維素，過(guò)度紫外照射的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上的含有的抑制物。
6 ? 放置PCR管時(shí)沒(méi)有配平，是否會(huì)對(duì)儀器及結(jié)果產(chǎn)生影響？
答：①、配平的主要目的是讓熱蓋壓在pcr管壓力、受熱均勻，若經(jīng)常不配平，會(huì)導(dǎo)致熱蓋傾斜，容易損壞儀器，建議按照儀器廠家要求進(jìn)行操作。②、不配平短期內(nèi)對(duì)結(jié)果無(wú)影響，若長(zhǎng)期熱蓋傾斜，受熱不均，有可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果異常。
7 ? 檢測(cè)結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)CT值小于10的情況，該如何解讀？
答：首先先看擴(kuò)增曲線是否正常，如果正常，代表病毒濃度較高。如果擴(kuò)增曲線異常，需要分析具體是哪類異常曲線導(dǎo)致的，其中斜直線是最常見(jiàn)的曲線異常，出現(xiàn)這種情況可以通過(guò)調(diào)節(jié)基線和閾值線解決。
8 ? 如果懷疑空氣中有氣溶膠污染，如何采集空氣中的樣本呢？
答：在未污染的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取適量的PCR八聯(lián)管，每個(gè)管內(nèi)加入25微升PCR反應(yīng)液，將PCR管打開(kāi)蓋子放置在懷疑有污染的實(shí)驗(yàn)室不同位置，半個(gè)小時(shí)后再蓋上蓋子進(jìn)行擴(kuò)增。若出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則說(shuō)明空氣中存在氣溶膠污染。9 ? 同一個(gè)樣本，第一次檢測(cè)為陽(yáng)性，然后進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果為陰性，這種情況該如何解讀？
答：此情況一般出現(xiàn)在弱陽(yáng)性樣本中。對(duì)于弱陽(yáng)性樣本，存在著泊松分布，每次吸到的病毒含量均不同，甚至沒(méi)有吸到病毒，因此存在復(fù)測(cè)時(shí)平行結(jié)果不一致的情況。另外對(duì)于環(huán)境樣本等弱陽(yáng)性樣本，放置時(shí)間長(zhǎng)，核酸容易出現(xiàn)降解，也會(huì)出現(xiàn)復(fù)測(cè)時(shí)平行結(jié)果不一致的情況。出現(xiàn)此情況，建議重新采樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做三個(gè)平行，若有一個(gè)陽(yáng)性，則判定為陽(yáng)性。10 ? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性對(duì)照是陽(yáng)性，一般是什么原因？
答：陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性，若曲線正常，則表示環(huán)境存在污染，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔。若曲線是斜直線，考慮PCR反應(yīng)液蒸發(fā)或者掛壁、PCR管不干凈等因素。
11 ? 實(shí)驗(yàn)上機(jī)結(jié)束后，八連管中有絮狀物產(chǎn)生，是什么原因會(huì)出現(xiàn)這種情況？
答：若血液樣本使用免提取方法進(jìn)行操作，因里面含有蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致絮狀物的產(chǎn)生。若經(jīng)過(guò)核酸提取后還存在絮狀物，表明核酸提取過(guò)程中雜質(zhì)未去除干凈。
